|
Перепланировка квартир и любых помещений в Киеве НЕДОРОГО |
|
http://kiev-security.org.ua
Клетка - основная структурная и функциональная единица всех живых существ, будь то растение, животное или микроб. Некоторые организмы, например бактерии, некоторые водоросли и грибы, являются одноклеточными: весь организм целиком заключен в одну клетку. Человек, как представитель многоклеточных организмов, содержит приблизительно 3 тысячи миллиардов клеток. Клетки, соединенные между собой, формируют у многоклеточных организмов различные ткани, органы или структуры (у животных - мозг, печень, кости, кожу; у растений - листья, корни, плоды и т.п.).
Как правило, клетки очень малы, их диаметр чаще всего намного меньше 1 мм. Их трудно различить невооруженным глазом. Впервые их удалось разглядеть более 300 лет назад, вскоре после того, как были сконструированы первые микроскопы. Клетки высших организмов (растения и животные) имеют следующее строение. Клетки окружены мембраной, состоящей из липидов. Мембрана проницаема только для определенных молекул питательных веществ и ионов. Благодаря этому содержимое клетки удерживается внутри и не вытекает в окружающую среду. Растительные клетки имеют дополнительную клеточную стенку, состоящую из целлюлозы, которая придает растительным тканям структурную жесткость. Во всех клетках, кроме бактериальных, внутреннее клеточное пространство разграничено на окруженное мембраной сферическое тельце, называемое ядром, и цитоплазму. Ядро - это командный центр клетки. В нем находится ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), в которой закодирована почти вся необходимая для жизни клетки, а также всего организма, наследственная информация: инструкции, управляющие ростом, делением и специфическими особенностями клеток. ДНК в ядре находится в виде извитых тяжей, известных под названием хромосом. Клетки, имеющие ядро, называются эукариотическими, лишенные ядра клетки бактерий и сине-зеленых водорослей называются прокариотическими. Цитоплазма содержит различные органеллы, которые выполняют функции, аналогичные функциям отдельных органов многоклеточного организма (пищеварение, накопление и сохранение питательных веществ и энергии, выделение). В хлоропластах (место, где происходит фотосинтез), а также митохондриях (они ответственны за запасание энергии) содержится небольшое, по сравнению с ядром, количество ДНК (а следовательно и генетической информации).
В бактериальных клетках основная масса ДНК содержится в одной большой кольцевой молекуле, которую называют бактериальной хромосомой. Помимо нее у многих бактерий есть большое количество очень маленьких кольцевых молекул ДНК, называемых плазмидами. Плазмиды способны размножаться и передаваться другим бактериальным клеткам независимо от главной хромосомы. Они были впервые идентифицированы как генетические элементы, несущие гены устойчивости к антибиотикам. Впрочем, они могут содержать и многие другие гены.
Главное свойство клеток - способность расти и делиться с образованием дочерних клеток. Чтобы выполнять эти функции, клетки должны быть устроены очень сложно. И действительно, даже простейшие из них содержат молекулы почти 1000 разных веществ. Клетки можно сравнить с крошечными фабриками, которые, используя в качестве сырья, строительных блоков относительно простые молекулы превращают их в многочисленные необходимые для роста и развития клетки сложные молекулы. В процессе роста и деления клетки нуждаются в энергии. В большинстве случаев они получают ее при расщеплении молекул, поступивших с пищей. Клетки растений, способные к фотосинтезу, используют энергию солнечного света.
Все молекулы веществ в клетке можно разделить в соответствии с их размерами на два основных класса. Один класс - это так называемые малые молекулы: простейшие сахара, аминокислоты и жирные кислоты. Второй класс клеточных молекул составляют макромолекулы, которые являются полимерами, образующимися в результате соединения определенных малых молекул (например, аминокислот) в длинные цепи (например, белки). Малые молекулы обычно состоят из 10-50 атомов, связанных строго упорядоченным образом. Полимерные молекулы содержат большое количество мономерных звеньев из малых молекул и в сотни-тысячи раз превышают их по своим размерам. В каждой клетке можно обнаружить приблизительно 750 типов малых молекул и до 2000 разных видов макромолекул.
Каждая из многих тысяч различных молекул, содержащихся в клетке, потенциально способна вступать в очень большое число химических реакций с другими клеточными молекулами. Однако при температурах существования живых организмов подавляющее большинство этих реакций не может происходить со скоростями, достаточными для поддержания жизни. В живых клетках нужные скорости реакций обеспечивают специальные катализаторы - так называемые ферменты. Как и все катализаторы, ферменты в ходе химических реакций не расходуются, и данная молекула может срабатывать тысячи раз за одну секунду. Большинство ферментов высоко специфичны, и каждый из них катализирует строго определенную химическую реакцию.
Как выяснилось сравнительно недавно (к 1935 году), все ферменты живых организмов по своей природе являются белками. В связи с этим изучение структуры и функций этого типа макромолекул привлекало (и продолжает привлекать) наибольшее внимание ученых. Было установлено, что белки - это полимерные молекулы, построенные из аминокислот. Известно 20 аминокислот, которые в разных белковых молекулах соединены в цепи в строго определенном порядке и соотношении. Это означает, что любая молекула белка характеризуется уникальной, характерной только для этого белка последовательностью аминокислот. Нарушение этого порядка может привести к нарушению каталитической способности фермента. Хотя белки в организме могут выполнять самые разнообразные, в том числе структурные функции (например, мышечные ткани построены из белков), основная их роль - катализ химических реакций. Можно сказать, что ферменты - это один из важнейших, ключевых элементов живой клетки, непосредственно связанных со всеми ее жизненными функциями.
Информация о составе и строении всех белков клетки, порядке их образования в ходе развития организма, то есть вся наследственная информация организма, закодирована в молекулах ДНК. У эукариотических организмов ДНК содержится в хромосомах, в каждой хромосоме по одной молекуле ДНК. Количество хромосом для каждого вида высших организмов является строго определенной постоянной величиной. Например, у человека 46 хромосом, пшеницы - 42. Появление дополнительных хромосом, или отсутствие какой-либо хромосомы может приводить к серьезным нарушениям в организме.
Важнейшее свойство клеток - способность делиться таким образом, что каждая из образовавшихся дочерних клеток ничем не отличается по хромосомному составу одна от другой и от материнской клетки. Это достигается благодаря тому, что накануне деления каждая из хромосом удваивается: в них образуется вторая молекула ДНК, абсолютно идентичная той, что уже там была. Этот процесс называется "репликация ДНК".
У высших организмов, которые размножаются половым путем, количество хромосом, как правило, четное. Более того, каждая из хромосом представлена в двух экземплярах: одна от "папы", вторая - от "мамы". Такие пары хромосом, которые кодируют одни и те же гены, называются гомологичными. В процессе образования половых клеток (яйцеклеток и сперматозоидов) гомологичные хромосомы сближаются и обмениваются отдельными участками (так называемая рекомбинация генов). В результате половые клетки в своих хромосомах содержат новые комбинации родительских генов. Процесс деления при образовании половых клеток несколько отличается от обычного клеточного деления. Каждая половая клетка получает только по одной из каждой пары гомологичных хромосом. Таким образом, сперматозоиды и яйцеклетки человека, например, содержат 23 хромосомы. Однако после оплодотворения яйцеклетки сперматозоидом нормальное число хромосом восстанавливается.
Молекула ДНК по своей химической структуре представляет полимер, состоящий из двух спирально закрученных друг вокруг друга цепей, соединенных между собой водородными связями (всем известная "двойная спираль"). Каждая из цепей содержит многие тысячи соединенных между собой в определенном порядке так называемых нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит, в свою очередь, из трех более простых молекул: азотистого основания, сахара дезоксирибозы и остатка фосфорной кислоты. Нуклеотиды различаются между собой только азотистыми основаниями: имеется два пуриновых (аденин и гуанин) и два пиримидиновых (тимин и цитозин) основания. Генетики обозначают разные нуклеотиды по содержащемуся в нем основанию: А-адениновый нуклеотид, Г - гуаниновый и т.д.
Две цепи ДНК являются строго комплементарными друг другу: адениновый нуклеотид одной цепи соединен водородными связями с тиминовым нуклеотидом другой цепи, соответственно цитозиновый нуклеотид соединен с гуаниновым. При удвоении ДНК, предшествующему делению клеток, происходит синтез новой молекулы ДНК, цепи которой комплементарны двум цепям исходной молекулы. Именно благодаря принципу комплементарности новая и старая молекулы ДНК абсолютно идентичны.
Порядок расположения четырех разных нуклеотидов в молекуле ДНК определяет последовательность аминокислот во всех белках, образующихся в клетке. То есть, наследственная информация организма записана в молекулах ДНК с помощью всего четырех "букв". Возникает вопрос: как же можно записать информацию о всех сложнейших процессах, проистекающих в организме, четырьмя буквами? Оказалось можно. Просто для этого надо использовать кодированную запись. Причем применяемый в природе код также оказался несложным: каждой из двадцати аминокислот, из которых построены белковые молекулы, соответствует определенное "слово", состоящее из трех "букв" - нуклеотидов. Например, аминокислоте лизин соответствует триплет нуклеотидов ААГ (аденин-аденин-гуанин), а аминокислоте аргинин - ЦГА (цитозин-гуанин-аденин). Эти триплеты получили название-кодоны. Несложно заметить, что такой код - "вырожденный": возможных сочетаний из трех "букв" намного больше, чем аминокислот. Поэтому отдельные аминокислоты могут быть закодированы разными "словами-синонимами". Например, тот же аргинин может быть закодирован и кодонами ЦГЦ, ЦГГ, АГА, АГГ. Из всех аминокислот только метионин и триптофан не имеют "синонимов". Тем не менее код является "неперекрывающимся": кодоны, кодирующие какую-либо аминокислоту, не могут служить кодом для другой аминокислоты. Благодаря этому запись последовательности кодонов в ДНК полностью соответствует последовательности аминокислот в соответствующем белке.
Участок ДНК, на котором закодирована информация о каком-то одном белке, называется геном. Средняя длина ДНК, кодирующая один ген, обычно соответствует приблизительно 1000 пар нуклеотидов. На одной молекуле ДНК обычно располагается большое количество генов, а также последовательности, оказывающие влияние на их активность, и некодирующие последовательности, роль которых пока неясна. Растения имеют 35-40 тысяч генов, у человека их около 70 тысяч. Можно себе представить, какой объем информации записан на ДНК. Длина ДНК одной клетки человека - 2 метра, а общая длина ДНК одного человека приблизительно 60 тыс. миллиардов километров. Это соответствует расстоянию от Земли до Луны и обратно, умноженному на 800! Несмотря на это механизм использования наследственной информации работает исключительно четко и практически без сбоев. Как это достигается?
ДНК не может непосредственно участвовать в синтезе белков. Она является только местом, где записана информация о них, подобно жесткому диску компьютера. Синтез белков происходит в специализированных рибонуклеопротеидных (то есть состоящих из рибонуклеиновой кислоты и белка) частицах, называемых рибосомами. Для того, чтобы доставить информацию из "жесткого диска компьютера" (ядра клетки с хромосомами) к месту сборки белков, используется "дискета", в качестве которой выступает так называемая информационная, или матричная рибонуклеиновая кислота (мРНК). РНК по своей природе очень близка к ДНК. Это тоже полимер, но имеющий только одну нить, и нуклеотиды содержат вместо сахара дезоксирибозы - рибозу. Нуклеотиды, составляющие молекулу РНК, аналогичны тем, что содержатся в молекулах ДНК: А, Г, Ц, а также У-урациловый, который близок по структуре Т - тиминовому нуклеотиду ДНК и который так же, как и Т, комплементарен А. "Списывание" информации с "жесткого диска" (ДНК) на "дискету" происходит путем образования молекулы мРНК, комплементарной одной из нитей ДНК. Таким образом, последовательность нуклеотидов в ней полностью идентична таковой другой нити ДНК. Разумеется, этой информации вполне достаточно для синтеза белка со строго определенной последовательностью аминокислот в соответствии с последовательностью нуклеотидов в ДНК. Процесс считывания информации с ДНК на мРНК называется транскрипцией, синтез белка в рибосомах в соответствии с информацией, записанной на мРНК - трансляцией.
Большинство генов имеет следующее строение. Впереди каждого гена на молекуле ДНК расположена последовательность нуклеотидов (она может быть по длине даже больше самого гена), которая регулирует его активность: "включение-выключение", интенсивность, место (например, в листьях растения на свету) и время работы (например, в период цветения). Эта регуляторная последовательность называется промотор. Кодирующая область гена начинается с триплета нуклеотидов АТГ, который указывает место начала считывания информации с мРНК при ее трансляции в рибосомах, и заканчивается так называемым стоп-кодоном (ТАГ, или ТАА, или ТГА), указывающим место окончания трансляции. Следом за участком ДНК, который кодирует последовательность аминокислот в белке (собственно ген), располагается последовательность, обеспечивающая присоединение к мРНК так называемого "полиаденилового хвоста" (полиА), который предохраняет мРНК от разрушающего действия внутриклеточных ферментов при перемещении ее из ядра к рибосомам, и последовательность нуклеотидов, указывающая место окончания транскрипции.
Транскрипция осуществляется следующим образом. В области промотора находится специальная последовательность, к которой присоединяется молекула фермента, катализирующего образование мРНК. Нити ДНК временно расплетаются, и фермент, "проходя" вдоль кодирующей области одной из нитей ДНК и используя ее в качестве матрицы, обеспечивает синтез мРНК.
Полученная мРНК из ядра переходит в цитоплазму, где на рибосомах происходит синтез белка (трансляция). При этом мРНК выступает в качестве матрицы, на которой происходит сборка цепи аминокислот. В этом процессе участвуют также молекулы РНК другого типа - транспортные РНК (тРНК), которые связываются с аминокислотами перед включением их в белок. Фактически они доставляют их к месту синтеза белка. Причем каждой аминокислоте соответствует определенная тРНК, которая умеет узнавать соответствующий своей аминокислоте кодон на молекуле мРНК. Это оказалось возможным благодаря уже известному нам принципу комплементарности нуклеиновых кислот. тРНК имеет последовательность из трех нуклеотидов, комплементарных кодонам соответствующих аминокислот. Эти последовательности получили название - антикодоны. В ходе трансляции мРНК протягивается через рибосому таким образом, что последовательные кодоны оказываются в положениях, при которых возможно присоединение соответствующей аминокислоты. Соответствующие антикодоны тРНК узнают готовый к сборке кодон мРНК и к собираемой цепи белка добавляется очередная аминокислота, которая должна быть именно в этом месте цепи.
Ни одна клетка никогда не использует всю информацию, закодированную в ДНК ее хромосом. Клетки в организме разделяют свои обязанности - они специализированы. Клетки мозга не образуют инсулин, клетки печени - слюну, а клетки кожи -кости. Это же относится и к растениям: клетки корня не синтезируют зеленый пигмент хлорофилл, а клетки листа не образуют пыльцу или нектар. Работа генов, ответственных за производство каких-либо веществ, зависит от возраста организма. Молодые растения не образуют веществ, связанных с процессом созревания плодов, у пожилых людей, как правило, не могут расти новые зубы. В придачу ко всему, регуляция активности генов тесно связана с условиями окружающей среды.
Рассмотрим для примера, как функционирует ген, кодирующий образование инсулина (гормона, регулирующего содержание сахара в крови). Если поступает сигнал (в виде специальной молекулы-"посыльного"), что в крови не хватает инсулина, то эта молекула прежде всего находит промотор гена, кодирующего инсулин. Она присоединяется в определенном месте (которое она может распознать) промотора, и это служит сигналом к включению механизма работы (экспрессии) гена. Когда инсулина в крови становится достаточно, поступает сигнал о "выключении" гена.
Человек, занимающийся выведением новых сортов растений или пород животных, - селекционер, может с помощью подбора родительских форм получить гибридное потомство, у которого активность отдельных генов выше или ниже по сравнению с обычным уровнем, характерным для какого-либо растения или животного. Например, получить сорта картофеля с повышенным содержанием крахмала, или сорта рапса, не содержащие в масле токсичные вещества типа эруковой кислоты. Но селекционер не может заставить листья того же рапса образовывать масло, которое обычно синтезируется в семенах, хотя в хромосомах клеток листа содержится вся необходимая для этого информация. Конечно, можно попытаться "обмануть" растение, заставив его листья образовывать масло. Для этого необходимо у гена, кодирующего образование масло, поменять промотор, поставив его под промотор того гена, который функционирует в листьях. Однако здесь кончается традиционная селекция и начинается генетическая инженерия.
В основе традиционной селекции лежит, прежде всего, поиск оптимального сочетания в одном организме генов, полученных от разных родительских форм. Для этого проводят гибридизацию различных сортов или селекционных линий одного вида, обладающих какими-либо ценными признаками (высокая продуктивность, устойчивость к болезням и вредителям и т.п.). Чем выше генетическая изменчивость внутри вида (широкий выбор селекционно-ценных генов), тем, как правило, выше эффективность селекции. Но есть виды сельскохозяйственных растений, для которых естественная внутривидовая изменчивость невысока (например, свекла). Многие ценные гены у видов культурных растений могут отсутствовать совсем (например, гены устойчивости к некоторым болезням, вредителям). Поэтому в селекции широкое распространение получили методы, направленные на расширение генетического разнообразия вида с помощью экспериментального мутагенеза или отдаленной гибридизации. В первом случае организм подвергается действию факторов, вызывающих различные нарушения в структуре ДНК: радиации, обработке химическими веществами, обладающими мутагенной активностью. Большинство индуцированных таким образом нарушений имеет неблагоприятные последствия для организма. Однако отдельные мутации могут быть весьма полезны с селекционной точки зрения.
Отдаленная гибридизация между культурными растениями и родственными дикими видами позволяет не только расширить генетическую изменчивость культурного вида, но, что наиболее важно, и привнести отдельные ценные гены от дикого вида, отсутствующие у культурного вида. Подобные скрещивания обычно являются весьма сложным делом, поскольку между видами существуют жесткие репродуктивные барьеры. Чаще всего пыльца чужого вида не может расти на пестике и оплодотворить яйцеклетку. Если оплодотворение все же произошло, то семена получаются нежизнеспособными из-за недоразвитого эндосперма (питающего элемента семени), или из семени развиваются стерильные гибриды. Между видами существуют также жесткие барьеры, затрудняющие естественную рекомбинацию. Это означает, что хромосомы межвидового гибрида, полученные от разных видов, могут отличаться по количеству и гомологии (сходству). Отсутствие гомологии между хромосомами приводит к тому, что они не способны сближаться и обмениваться отдельными участками (а следовательно и отдельными генами) в процессе образования половых клеток. В результате становится невозможным привнесение нужных генов от дикого вида в генетический материал культурного вида. Поэтому отдаленная гибридизация может быть эффективна только в том случае, когда скрещиваются относительно близкие виды.
Проблема отсутствия рекомбинации у отдаленных гибридов может быть решена посредством удвоения у них количества хромосом. В этом случае каждая хромосома будет иметь себе пару, и процесс образования половых клеток протекать нормально. Такие гибриды, объединяющие в своем геноме полные (т.е. двойные) наборы хромосом разных видов (их называют амфидиплоиды), весьма широко распространены в природе. Наиболее известные из них - пшеница, слива. Но если селекционер вздумает получить амфидиплоид с участием культурного и дикого вида, то он должен иметь в виду, что у этого гибрида помимо селекционно-ценных генов дикого вида, будет присутствовать и полный набор нежелательных "дикарских" генов. Избавиться от них можно только путем возвратных скрещиваний с культурным видом, в ходе которых геном дикого вида замещается культурным, и лишь отдельные ценные гены дикого вида сохраняются благодаря селекции. Однако эта процедура может быть эффективной только в случае относительно высокой гомологии хромосом этих видов (то есть они должны быть относительно близкородственными). Круг замкнулся. Не случайно поэтому единственным амфидиплоидом, представляющим селекционную ценность из числа полученных искусственно, остается тритикале - гибрид между двумя культурными видами: пшеницей и рожью.
Как видим, традиционная селекция имеет целый ряд ограничений, не позволяющих эффективно использовать все многообразие генов, существующее в природе. Генетическая инженерия позволяет в значительной мере обойти все естественные межвидовые репродуктивные и рекомбинационные барьеры. Она дает возможность оперировать (комбинировать, переносить от одного вида к другому) любыми генами, принадлежащими совершенно не родственным организмам или даже синтезированными искусственно. Все это стало возможным благодаря выдающимся достижениям в изучении законов наследственности, среди которых на первом месте стоит открытие универсальности построения и функционирования генетического материала живых организмов на планете Земля.
В проекте Закона Республики Беларусь "О безопасности в генно-инженерной деятельности" дается следующее определение генетической инженерии: "Генетическая инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства".
Первый этап создания генно-инженерных организмов - выделение и идентификация отдельных генов (соответствующих фрагментов ДНК или РНК), которые собираются перенести другим организмам. Для этого из организмов, обладающих такими генами, с помощью специальных химических методов выделяют нуклеиновые кислоты и разрезают их на отдельные фрагменты, используя наборы ферментов - рестриктаз. Первые рестриктазы были выделены в 1970 году Г.Смитом (США). Оказалось, что разные рестриктазы способны производить разрывы молекулы ДНК в строго определенных последовательностях нуклеотидов (из 4-6 пар). Наибольшее значение имело выделение рестриктаз, которые дают фрагменты с так называемыми "липкими" (комплементарными) концами. В случае их использования разрывы ДНК происходят в местах, расположенных наискось: на концах каждого из полученных фрагментов остаются короткие одноцепочечные "хвосты" из нескольких нуклеотидов. Если объединить в одной пробирке фрагменты ДНК любого происхождения, полученные с помощью одной и той же рестриктазы, дающей "липкие концы", и добавить фермент ДНК-лигазу, то эти фрагменты соединятся между собой. В результате получится химерная - "рекомбинантная" ДНК, которая может содержать фрагменты ДНК, выделенные из самых разных источников, или синтезированные искусственно. Описанная методика получила название "технология рекомбинантных ДНК". Ее по праву считают центральным звеном генетической инженерии. Поэтому можно сказать, что годом рождения генетической инженерии является 1972 г., когда появилась первая публикация сотрудников лаборатории П.Берга (США), в которой сообщалось о получении кольцевой молекулы ДНК вируса SV40, содержащей гены фага лямбда (фаги - это вирусы бактерий) и галактозный оперон (набор генов, ответственных за расщепление молочного сахара лактозы) бактерии Escherichia coli (E.coli).
В 1973 году была получена первая функционально активная молекула рекомбинантной ДНК. Г.Бойер и С.Коэн (США) сумели "пришить" к плазмиде E.сoli фрагмент ДНК плазмиды другой бактерии и обнаружили, что такая химерная плазмида могла успешно функционировать в клетках E.сoli, размножаться и передаваться другим клеткам как естественным путем, так и с помощью человека. Это означало, что таким образом можно получать многочисленные копии любых генов, то есть клонировать гены, нарабатывать требуемые для последующих манипуляций объемы генетического материала. В генетической инженерии в настоящее время используют различные микрорганизмы для клонирования генов, но чаще всего для этой цели привлекают хорошо изученную бактерию пищеварительного тракта человека - E.сoli.
С помощью набора разных рестриктаз получают многие тысячи фрагментов ДНК, содержащих самые разнообразные гены. Каким образом в этой смеси найти и выделить один единственный, который кодирует нужный нам ген? Это один из наиболее сложных и дорогостоящих этапов генетической инженерии. Для решения проблемы идентификации генов разработаны и успешно применяются многие методы. Останавливаться на их описании в рамках научно-популярного издания не представляется целесообразным. Замечу только, что в основе большинства из них лежит хорошо известный нам принцип комплементарности нуклеотидов ДНК.
Ученые научились не только выделять и клонировать нужные гены, но и всесторонне их изучать: определять последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК и аминокислот в белке, который кодирует ген, механизм регуляции его активности. Все это позволило успешно осуществлять следующий этап создания генно-инженерных организмов: построение конструкций генов, которые предполагается перенести в геном реципиентного организма (по определению генетической инженерии - "получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот"). Здесь не случайно идет речь о переносе не отдельных генов, а генетических конструкций, состоящих из нескольких генетических элементов: генов и регуляторных последовательностей. Как правило, конструкции собирают на основе определеных плазмид, к которым "пришивают" в определенной последовательности необходимые генетические элементы.
Как отмечалось выше, каждый ген имеет сложную систему регуляции своей активности, в отсутствие которой он просто не будет функционировать. Только для транскрипции гена (образования мРНК) обязательно наличие, помимо кодирующей области, также промотора, последовательности, обеспечивающей присоединение к мРНК полиА "хвоста", и последовательности, указывающей место окончания транскрипции. В придачу к этим обязательным элементам генетические конструкции могут содержать также регуляторные элементы, определяющие, например, место и время активности переносимого гена (трансгена), другие гены (с соответствующими генетическими элементами), например, так называемые маркерные гены, с помощью которых выделяют трансформированные клетки реципиентного организма (клетки, в ДНК которых произошло встраивание трансгена) среди преобладающей массы нетрансформированных клеток.
Такие генетические конструкции "собирают" из фрагментов ДНК, которые могут принадлежать совершенно разным организмам, относящимся к весьма отдаленным систематическим группам, и даже с участием фрагментов ДНК, синтезированных искусственно. Например, в плазмиду почвенной бактерии Agrobacterium tumеfaciens (A.tumefaciens) встраивают ген, выделенный из ДНК рыбы (ген холодоустойчивости от камбалы), промотор у этого гена от вируса мозаики цветной капусты, последовательности присоединения полиА-хвоста и окончания транскрипции (терминальные последовательности) от A.tumefaciens, маркерный ген устойчивости к канамицину из транспозона (подвижный генетический элемент) E.coli, промотор и терминальные последовательности у этого гена те же, что и у гена холодоустойчивости. И вся эта генетическая конструкция предназначена для переноса в растительный организм.
Выбор промотора при создании трансгенных конструкций имеет особое значение. Существует общая закономерность: прокариотические промоторы могут обеспечить активность любого гена, в том числе и эукариотического, только в прокариотическом организме (у бактерий, сине-зеленых водорослей). В эукариотическом организме может функционировать только ген, имеющий эукариотический промотор. Поэтому при переносе генов от одного вида растений к другому можно использовать гены с их собственными промоторами. Но если в растение переносится бактериальный ген, то промотор у него должен быть заменен на растительный. В последнем случае часто используют промоторы от растительных вирусов. Вирусы по своей природе - существа исключительно активные. Ничто, или практически ничто, не может их остановить после того, как они нашли свою жертву (хозяина). Попав в клетку хозяина, вирусная ДНК интенсивно размножается и, используя "строительный материал и технику" (рибосомы и молекулы, необходимые для трансляции) клетки хозяина, активно воспроизводит себе подобных. Это происходит в силу того, что в процессе эволюции вирусы получили очень сильные промоторы, способные функционировать в любом генетическом окружении. Для генетической инженерии такое свойство вирусных промоторов очень ценно, поскольку обеспечивает активную работу привнесенного в организм трансгена. Правда, с другой стороны, регулировать активность такого гена очень сложно: он работает постоянно и с одинаковой интенсивностью. Во многих случаях это как раз то, что и требуется. Если исследователь ставит более сложные задачи в плане регулирования активности трансгенов, то в его распоряжении имеется в настоящее время достаточно широкий выбор промоторов и других регуляторных элементов, комбинирование которых позволяет достичь более тонкой регуляции активности трансгенов в пространстве (в определенных тканях растения) и времени (в определенный период развития).
Тут надо иметь в виду, что есть организмы одноклеточные и многоклеточные. В первом случае все просто: имеются хорошо отработанные методы введения рекомбинантных молекул ДНК в клетки микрорганизмов. Если сконструированная плазмида способна к самовоспроизведению, то она будет размножаться внутри клетки. В свою очередь, сами клетки реципиентного организма быстро делятся вместе с привнесенными в них плазмидами. Так осуществляется клонирование генов в микрооргнизмах. Если стоит задача получить генно-инженерный микрорганизм, то добиваются, чтобы привнесенная в клетку генетическая конструкция включилась (устойчиво интегрировалась) в хромосому реципиентного организма.
Для получения генно-инженерных многоклеточных организмов поначалу трансформируют (то есть, вводят нужный ген) лишь отдельные клетки, из которых затем восстанавливают целый организм. Понятно, что это не простая задача - восстановить организм из отдельной клетки. Однако ученые научились делать это. Так, для получения трансгенных животных (например, млекопитающих: мышей, кроликов, овец, коров и т.д.) чаще всего используют оплодотворенные яйцеклетки, в которые с помощью микроманипуляторов впрыскивают препараты ДНК, а затем имплантируют эти яйцеклетки в матки суррогатных матерей, где из таких яйцеклеток развиваются младенцы, часть из которых может содержать в своем генетическом материале привнесенные гены.
С растениями ситуация, с одной стороны сложнее, с другой –проще. Сложнее – потому, что каждая растительная клетка окружена плотной целлюлезной оболочкой, что создает проблемы с введением в клетку чужеродной ДНК. Проще – потому, что, в отличие от животных, большинство растительных клеток тотипотентны, т.е. из них можно восстановить целое растение (у животных этим свойством обладают только оплодотворенные яйцеклетки и клетки зародыша на самых ранних стадиях развития). В придачу ко всему для растительных клеток разработаны эффективные методы их культивирования вне организма на специальных питательных средах и разработаны методы индукции у низ процессов морфогенеза (с помощью фитогормонов, изменения условий культивирования), в результате чего достигается регенерация из клеток целых организмов.
Проблема введения в растительную клетку чужеродной ДНК также в принципе решена. Используется два основных подхода. Первый из них – агробактериальная трансформация – это слегка модифицированный естественный процесс горизонтального (то есть между отдаленными в систематическом отношении группами организмов) переноса генов от бактерий в растения. В природе существует большая группа почвенных бактерий из рода Agrobacterium. Они могут вызывать у растений болезни типа рака – корончатый галл (опухоль) или «бородатые корни». Выяснилось, что болезнь начинается после того, как бактерии передали с помощью специального механизма в генетический материал растений небольшой фрагмент своей ДНК, содержащий гены, активность которых у растений приводит к образованию опухоли или многочисленных корней, в которых синтезируются вещества – опины – являющиеся питательным субстратом исключительно для агробактерий. Ученые просто вырезали из переносимого фрагмента ДНК бактериальные гены, вызывающие болезнь, и заменили их нужными им генами с соответствующими регуляторными элементами. Агробактерии затем убивают с помощью антибиотиков, а из трансформированных клеток восстанавливают целое растение.
К сожалению, метод агробактериальной трансформации оказался недостаточно эффективным для большинства однодольных растений (хлебных злаков, кукурузы, лилейных и др.). Поэтому для введения чужеродной ДНК в клетки таких растений чаще всего используют другой метод – бомбардировки клеток микроскопическими частицами из золота или вольфрама, на поверхность которых нанесена ДНК.
Процесс переноса и включения в генетический материал клеток растений чужеродной ДНК происходит в общем с небольшой частотой: в лучшем случае трансформированной оказывается одна клетка на тысячу. Поэтому необходимо каким-то образом отделить такие клетки от остальных, создать для их деления и дальнейшего развития наиболее благоприятные условия. Для этих целей вместе с желаемым геном (например, устойчивости к насекомым вредителям, вирусам, гербицидам) вводят и второй ген – так называемый селективный ген. Чаще всего для этого используют гены устойчивости к антибиотикам. Если поместить клетки после введения чужеродной ДНК на питательную среду с антибиотиком, то ней способны будут расти только трансформированные клетки.
Обычно в генетический материал клеток растений включается одна или две копии привнесенных генов. Многокопийность, как правило, сопровождается пониженной активностью привнесенных генов, а генотипы с несколькими копиями трансгенов не обладают требуемыми признаками и выбраковываются в ходе селекционного процесса. Даже в случае встраивания одной копии трансгена его активность может быть недостаточной. Поэтому получают много трансформантов, из которых отбирают лучшие по активности трансгенов и по комплексу хозяйственных признаков, без видимых мутаций и других нарушений.
Явление ослабления активности гена при увеличении числа его копий (оно получило название сайлэнсинг-замолкание) весьма широко используется в генетической инженерии для улучшения качественных характеристик сортов или пород. Так, с помощью привнесения дополнительных копий отдельных генов растений получены томаты с длительным сроком хранения (у них снижена активность фермента, разрушающего в процессе естественного созревания пектин, или фермента ответственного за образования фитогормона – этилена), картофель с повышенным качеством крахмала (без амилозы), соя, рапс с улучшенным качеством масла, кофе без кофеина. В генетической инженерии животных таким образом снижают активность генов, ответственных за выработку белков-аллергенов (в креветках, в молоке коров, коз).
Таким образом, генно-инженерные организмы отличаются от исходных генотипов весьма незначительно: к 25-35 тысячам существующих генов добавляют один-два новых. При этом следят, чтобы активность собственных генов растения или животного не изменилась (если это изменение не является целью генетической модификации), чтобы не ухудшились его потребительские качества.
| <a href="http://kiev-security.org.ua" title="Самый большой объем в сети онлайн инф-ции по безопасности на rus" target="_blank"><img src="http://kiev-security.org.ua/88x31.gif" width="88" height="31" border="0" alt="security,безопасность,библиотека"></a> |